苯丙氨酸解氨酶
近日，The Plant Journal 在线发表了中国科学院成都生物研究所题为“PAL-mediated biosynthesis pathway contributes to nematode resistance in wheat”的研究论文。该研究揭示了苯丙氨酸解氨酶 PAL 在禾谷孢囊线虫抗性反应中的调控作用及机制。
禾谷孢囊线虫（cereal cyst nematode, CCN）是小麦生产上重要的病原线虫CCN侵染会导致植株矮化、黄化，进而造成产量损失。然而，小麦种内CCN 抗性基因较为缺乏，一些已报道的QTL 位点也缺乏功能验证。因此，从小麦近缘抗CCN 的物种中挖掘抗性相关基因，并通过基因工程将其转入小麦中，是提高小麦CCN 抗性的一个思路。
易变山羊草 1号（Aegilop svariabilis No.1，2n=4x=28,UUSvSv）同时抗根结线虫（rootknot nematode，RKN，Meloidogynenaasi）和 CCN (Person-Dedryverand Jahier,1985,Rivoal et al., 1986, Barloy et al., 2007)。该材料不仅对来自 10个国家的14个 CCN 生理小种具有抗性 (Rivoal et al., 2001)，通过中国农科院植保所鉴定发现该材料对我国 CCN生理小种也具有抗性(邓洪新etal.,2001)，说明它可以作为小麦抗性育种的良好抗源。易变山羊草 1号对CCN的抗性可能来自两个基因CreX和CreY(Yu et al.,1991,Jahier et al., 1998)。中科院成都生物研究所余 懋群研究员在法国留学期间，将易变山羊草 1号外源片段转移到小麦背景中，获得了抗RKN的小麦材料 E10 (Yu et al.,1990)，该材料可能携带CreY，对CCN 同样具有抗性（Barloy et al.,2007）。Barloy et al.(2000)利用 E-10 等材料筛选获得与抗性基因CreY紧密连锁的RAPD标记OpY16-1065、OpB12-1320和OPN20-1235， 发现它们与抗性基因的遗传距离分别为 0cM、0.8cM和 1.7cM (Barloy et al.,2000)。闫乃红等(2003)和Barloy et al.(2007)等又将 OpY16-1065转化成更稳定的SCAR标记SCY1065。1997 年，Evans 等利用图位克隆法在节节麦抗CCN基因位点 Cre3获得了一个 NBS-LRR类基因序列。余懋群团队的邓洪新、闫乃红、刘毅和翟旭光等基于该基因，在易变山羊草 1号中开展了同源克隆的尝试(邓洪新等 2001, 闫乃红等 2004, 刘毅等 2006，Zhai et al.,2008)。然而，由于缺少基因组信息、抗性鉴定困难等因素，通过正向遗传学从易变山羊草 1号中克隆抗 CCN基因十分困难。
2011年，课题组对易变山羊草1号开展了CCN接种前后的转录组学分析，发现苯丙氨酸代谢和色氨酸代谢途径相关基因的表达明显受到CCN侵染的诱导，包括编码两条途径关键酶的基因，AevPAL1(phenylalanine ammonia-lyase) 和AevTDC1 (tryptophandecarboxylase) (Xu et al.,2012)， 推测这两条途径可能参与调控CCN抗性，并就此对这两个关键酶基因开展功能研究。
在之前的研究中，我们克隆了 AevTDC1 全长编码序列，并验证了 CCN 可显著诱导其表达，BSMV 介导沉默 AevTDC1 后以及 TDC 酶活抑制剂S-αFMT 处理植株后，都可显著增加易变山羊草 1 号根部侵染的 CCN 数目(Li et al., 2016, Huang et al., 2018)。将 AevTDC1 导入到普通烟草中使其过量表达，可显著减少烟草根部形成的根结数目，提高烟草对 RKN 的抗性。TDC 催化色氨酸转化为色胺，色胺是 IAA 生物合成的一种前体。研究发现沉默或者过量表达AevTDC1，均不会显著改变 IAA 的含量及其合成和信号基因的表达，表明AevTDC1对CCN 抗性的影响与 IAA 无明显关系。另外，TDC 下游的代谢产物含量受 AevTDC1 表达影响发生了显著变化，但这些产物对CCN抗性的作用尚无直接证据(Huanget al., 2018）。
在本项研究中，我们克隆了AevPAL1，确认了该基因表达受CCN 诱导，沉默该基因后显著增加了易变山羊草1 号根部侵染的CCN 数目，表明AevPAL1 对CCN 的抗性具有正向作用（图 1）。植物 SA主要 ICS 和 PAL两条途径合成，但不同物种中，这两条途径的贡献不完全相同(Garcion et al., 2008, Shine et al., 2016, Hao et al., 2018)。本研究发现，沉默 AevPAL1后会显著降低本底 SA 含量，但沉默AevICS 并不明显改变本底 SA 的含量，表明在易变山羊草 1 号中PAL 途径是SA 本底合成的主要途径。外源 SA 处理可显著提高山羊草对CCN的抗性，表明SA 对CCN 抗性具有正调控作用（图 2）。
图 1：沉默 AevPAL1 降低了易变山羊草 1号对 CCN 的抗性
图 2：沉默 AevPAL1 或 AevICS 对本底 SA 含量的影响，以及 SA 对CCN抗性的作用
PAL和TDC分别位于莽草酸下游的两条分支代谢途径，且AevPAL1 和AevTDC1的表达都受CCN诱导，对CCN抗性都具有正向作用，二者之间 的关系如何，我们也进行了初步探讨。研究发现，沉默AevPAL1或者 AevTDC1， 均可同时降低二者的表达以及本底 SA的水平。广靶代谢组学分析发现，沉默AevPAL1或 AevTDC1会一致性地导致两条代谢途径下游产物含量的显著降低（图 3），表明在易变山羊草 1号中AevPAL1和 AevTDC1存在表达正相 关性，进而协同影响下游代谢产物。从下游含量变化显著的物质中挑选了可能与植物抗逆抗病相关的芦丁和丁香酸，我们采用不同浓度对 CCN进行处理，结果表明这两种物质并不影响CCN的存活率。是否有其他代谢物参与了抗性作用有待进一步研究。
图 3：AevPAL1和 AevTDC1的表达及对两条代谢途径物质的相互影响
为进一步验证AevPAL1在小麦中的应用价值，我们采用了ubiquitin启动子在小麦中过量表达 AevPAL1。表型调查发现，过表达AevPAL1并不会对小麦株高、有效穗数、穗粒数和千粒重等产量相关性状造成负面影响，但可以显著减少根部CCN侵染以及土壤中形成的孢囊的数目， 表明AevPAL1在小麦中也能对CCN抗性起正调控作用（图 4）。同时，AevPAL1和AevTDC1过表达小麦的本底SA水平都显著地高于对照品种Fielder，PAL与TDC表达的正相关性在转基因小麦中也被验证（图 5），表明PAL与TDC这种相互关系可能在小麦族内比较保守。
图 4：AevPAL1 过表达小麦的表型及对 CCN的抗性鉴定
图 5：小麦中 PAL 与 TDC 的表达相互关系及对 SA 含量的影响
本研究揭示了 AevPAL1 可能与AevTDC1协调作用，通过改变下游次生代谢物和本底SA的含量，进而影响CCN抗性（图 6）。AevPAL1 可作为有效的基因资源在小麦抗 CCN 育种中加以应用。
图 6：AevPAL1 和 AevTDC1 调控 CCN 抗性的作用网络
中国科学院成都生物研究所张海莉助理研究员为论文第一作者，龙海副研究员为通讯作者，余懋群研究员和邓光兵副研究员对该工作进行了指导和帮助。课题组已毕业博士黄秋兰、助理研究员梁俊俊、研究助理易玲和宋小娜参与了其中部分工作。特别感谢中国科学院遗传与发育研究所褚金芳研究员在激素检测方面的帮助，山东农业大学刘峰教授提供了禾谷孢囊线虫病土，山东省农科院作物所李根英研究员帮助构建了转基因株系，中国农业科学院植保所彭德良研究员和罗书介博士提供的线虫染色方法。本研究得到了国家自然科学基金（批准号 31501614），转基因重大专项2016ZX08009003-001），中科院西部博士人才项目，四川省农作物分子育种平台项目（2016NZ0103）和四川省农作物育种攻关项目（2016NYZ0030）的支持。
参考文献：Yang YX, J Ahammed G, Wu C, Fan SY, Zhou YH. Crosstalk among jasmonate, salicylate and ethylene signaling pathways in plant disease and immune responses. Current Protein and Peptide Science. 2015 Aug 1;16(5):450-61.
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