谷氨酰胺转胺酶
谷氨酰胺转氨酶催化的蛋白交联改变蛋白结构从而消减中国对虾原肌球蛋白致敏性
作者：Linglin Fu（傅玲琳）, Saiqiao Ni, Chong Wang（王翀）, Yanbo Wang（王彦波）
作者单位：浙江工商大学食品与生物工程学院
杂志：Food and Agricultural Immunology
影响因子：2.568 2区
原文链接：
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/09540105.2019.1580250?scroll=top&needAccess=true
DOI：10.1111/lam.12687
翻译：丁寅翼
校对：王翀
摘要
背景：谷氨酰胺转氨酶（TG）是食品加工过程中一种主要的酶，会引起蛋白质的交联。原肌球蛋白（TM）是甲壳类水产品中主要的过敏原，在虾引起的过敏事件中占80%。本文目的在于分析TG引起的TM结构变化，研究TG对TM致敏性的影响。
方法与结果：本文首先用TG处理TM，然后一方面利用海鲜过敏患者血清，用间接ELISA的方法分析TM的致敏性。另一方面，用圆二色谱（CD）、紫外吸收光谱（UV）、荧光光谱检测TM的结构变化。结果显示，TM的致敏性随着TG处理的时间延长而降低。TG处理引起TM结构中β折叠和UV吸收的增强。
结论：TG引起的蛋白质结构变化运用于食品加工中，能够有效降低TM的致敏性，在食品工业中有很好的应用前景。
1. TG催化TM蛋白交联
如图1所示，TG处理8小时，TM的主条带（37 kDa）颜色变浅，但是高分子量区域的条带的信号强度增加（大约200 kDa和76 kDa），说明蛋白交联增加。此外，随着酶的添加量的增加，聚合物的信号也逐渐增加，出现剂量依赖效应。
图1 不同剂量TG处理TM后的SDS-PAGE结果
使用ELISA方法检测过敏人群的血浆，分析IgE的结合能力，从而评估TM的致敏性。发现TG处理后，TM的致敏性只出现了很小程度的下降，与酶的添加量和TM单体的含量无关（图2）。
图2 不同添加量的TG对TM的致敏性的影响
我们认为，TG引起的蛋白交联并不会直接影响TM的IgE表位，TM的聚合物的致敏性与TM单体相近。
2. TG影响TM的酶动力学分析
如图3所示，TM聚合物在TG处理初期就开始出现（0.5小时），并且随着TG暴露时间的延长而增加。反应终止时间是24小时，在这个时间点，几乎所有的TM均出现了聚合，TM单体几乎不存在。值得注意的是，在TG暴露16小时候，交联TM蛋白的条带亮度出现了下降。其原因可能在于，蛋白结构的快速变化，以及极大分子量的多聚物出现，导致产物无法进入聚丙烯酰胺胶，或直接发生沉淀而无法被检测到。
图3 不同时间点下TG处理TM的SDS-PAGE结果
该结果说明，TG引起TM的蛋白交联是一个缓慢，而多步骤的过程。
如图4所示，在用TG处理TM 12个小时内，TM的致敏性几乎没有变化。然而处理14个小时候，TM的致敏性在很长一段时间内均出现下降。处理24小时后，TM的致敏性几乎消失。
图4 不同时间点下TG影响TM的抗原特性
有趣的是，TM致敏性的变化与图3中总体TM信号（包括单体和聚合物）相关。说明，只有完整的或稍微被改变过的TM能够结合IgE，并引发下游的过敏反应。
3. TG处理过程中TM的二级结构变化
如图5所示，CD结果中，完整的TM在208 nm和220 nm处有两个负向峰，说明TM的α螺旋是主要结构。TG处理后，上述两个峰信号减弱，且与TG的处理存在时间效应。
图5 CD分析TG处理对TM的结构的影响
如图6所示，TG处理24小时后，TM的α螺旋降至29.6%，β转角、无规则弯曲、β折叠分别增加38.4%、31.4%、0.7%。
图6 TG对TM二级结构的影响
如图7所示，TG处理后，TM的荧光最大发散峰出现1-5 nm的蓝移，说明色氨酸残基的微环境发生了变化。
图7 TG对TM荧光特性的影响
TM的UV最大吸收峰为280 nm，TG处理后出现蓝移，且总吸收强度增加，说明TG对特定氨基酸产生的影响，例如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
图8 TG对TM的UV吸收的影响
上述结果说明，TG能够改变TM的蛋白质结构，从而可能会影响TM的致敏性。
4. TG诱导TM结构变化
与TM致敏性的消减相关
如图9A所示，TG导致TM的α螺旋、β转角、无规则弯曲、β折叠的程度均出现了变化。如图9B、C，以及表1所示，TM致敏性的变化与其荧光强度和UV吸收的变化均存在相关性。其中，UV吸收的变化更能反映致敏性的变化。
图9 TG处理引起TM结构变化与其致敏性变化的相关性
表1 TM致敏性与其他参数的Pearson双变量分析结果
结论
本研究发现，TG处理通过较慢的多步骤反应诱导TM出现蛋白交联，从而降低TM与IgE结合的能力。其中，TM的β折叠水平，以及分子内部的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸微环境变化对于致敏性的降低尤为重要。
相比其他方法，例如加热、超高压，TG催化蛋白交联的方法能在更温和条件下更加有效，并且可以通过UV吸收的方法比较简单地进行预测和评估，因此该方法更适用于食品加工。然而，该方法存在反应时间长的缺点，因此还需要进一步的研究。
Shewanella baltica OS155通过由环二肽和孤儿基因LuxRs组成的群体感应系统正向调控其致腐能力和菌膜形成
作者：Yanbo Wang（王彦波）, Feifei Wang, Chong Wang（王翀）, Xiuting Li, Linglin Fu（傅玲琳）
作者单位：浙江工商大学食品与生物工程学院
杂志：Frontiers in Microbiology
影响因子：4.019 2区
DOI：10.3389/fmicb.2019.00135
翻译：丁寅翼
校对：王飞飞
摘要
背景：研究发现，Shewanella baltica通过群体感应系统（QS）来调节其致腐能力和菌膜形成，但是相关的深层机制还未见报导。
方法与结果：本研究中，我们选择S. baltica OS155（大黄鱼的特定腐败菌）通过UHPLC-MS/MS检测到了QS自诱导因子，利用自调节实验检测到了细胞密度依赖的luxR型基因。通过体外结合实验发现了cyclo-(L-Pro-L-Phe)(PP)和LuxR01、LuxR02蛋白结合。LuxR型基因（luxR01和luxR02）的缺失会影响S. baltica OS155的致腐能力和菌膜形成。通过链特异性转录组分析和qRT-PCR验证发现，敲除luxR01和luxR02基因后，致腐/成膜相关基因torS、speF、pomA的表达显著下降。此外，添加外源PP能够增强S. baltica OS155的致腐能力和菌膜形成，而对luxR01和luxR02敲除的菌株没有效果。
1. S. baltica OS155细胞
密度依赖LuxR型蛋白的挖掘
如图1所示，luxR01、luxR02、luxR03、luxR05、luxR06基因的表达均不同程度的显著上调。
图1 S. baltica OS155细胞密度依赖LuxR型蛋白表达
该结果初步说明，S. baltica OS155具有QS系统，且luxR01、luxR02、luxR03、luxR05、luxR06是LuxR家族的成员。
2. LuxR型蛋白和自诱导因子之间的互作
如图2所示，与pET-15b对照相比，在LuxR01和LuxR02蛋白结合体系中发现了PP的存在，而其他LuxR型蛋白无法结合任何自诱导因子。
图2 cyclo-(L-Pro-L-Phe)（PP）和LuxR01、LuxR02的相互作用
该结果说明，PP是S. baltica OS155的LuxR01和LuxR02蛋白的自诱导因子。
3. 基因缺失变株的致腐能力
如图3A1和A2，除了SB7305菌株以外，所有的基因缺失株的TMA产量均少于野生型。只有SB7301和SB7302缺失株的腐胺分泌减少（图3B1、B2）。此外，培养基中前体物质浓度越高，SB7301和SB7302缺失株产生的TMA和腐胺量较野生株减少的也越多。
图3 基因缺失变异菌株的致腐能力
该部分结果说明，LuxR01和LuxR02对致腐能力的作用大于其他LuxR型蛋白。LuxR01和LuxR02双缺失的SB7307菌株TMA和腐胺的产量均低于SB7301和SB7302。
4. 基因缺失株的菌膜形成
如图4A所示，SB7301、SB7302，以及SB7303缺失株的成膜能力显著下降，任何一个基因的缺失都会导致菌株成膜能力下降一半以上。如图4B所示，SB7301和SB7302的生物膜明显比野生株的生物膜薄，该结果与微孔板分析结果一致（图4C）。
图4 基因缺失菌株的成膜能力
该结果说明，QS受体蛋白LuxR01和LuxR02在S. baltica OS155的致腐能力和菌膜形成过程中起着非常重要的作用。
5. PP通过LuxR型蛋白依赖模式
促进菌株的成膜能力和致腐能力
如图5所示，微量滴定平板分析和CLSM成像分析均显示，PP显著促进了野生株的成膜能力，但是对SB7301和SB7302缺失株无作用。如图6所示，PP显著提升了S. baltica OS155的致腐能力，但是对于luxR01和luxR02缺失株效果不明显。
图5 Cyclo-(L-Pro-L-Phe)通过LuxR型蛋白依赖模式
促进菌株的成膜能力
图6 Cyclo-(L-Pro-L-Phe)通过LuxR型蛋白依赖模式
促进菌株的致腐能力
该结果说明，LuxR01和LuxR02协同地与PP互作从而调控QS诱导的各种表型，例如菌膜形成和致腐能力。
6. SB7301和SB7302缺失株的转录组分析
如图7所示，SB7301和SB7302缺失株成膜/致腐能力相关基因torS、speF、pomA的表达均显著下调。
图7 基因缺陷菌株的转录分析
上述结果说明，DKP-LuxR型QS系统通过对torS、speF、pomA基因的转录调节，从而从而控制S. baltica OS155的致腐能力和成膜能力。
结论
本研究表明，PP是S. baltica OS155 QS系统的自诱导因子，通过与其受体即两个孤儿基因luxRs调节致腐/成膜能力，PP-LuxRs型QS系统为水产品保鲜剂提供新靶点。
翻译：丁寅翼
排版：王雅清
