基因检测技术
本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》2016年5期409-413页作者：王泽华，郭 婧
作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，湖北武汉 430022
通讯作者：zehuawang@163.net
妇科恶性肿瘤因其较高的发病率及病死率，成为导致妇女死亡的主要原因之 一。据文献报道，近年来我国三大妇科恶性肿瘤的发病率总体呈上升趋势，且发病年龄有年轻化趋势。因而，能够早期发现、诊断及预防肿瘤的筛查手段显得尤为重要。
目前，各妇科肿瘤的主要筛查方法如下：（1）卵巢癌：经阴道超声及血清CA125、人附睾蛋白4（HE4）水平检测。（2）宫颈癌：宫颈液基细胞学（TCT或LCT），阴道镜+活检，人乳头瘤病毒（HPV）检测。（3）内膜癌：内膜细胞学，经阴道超声及子宫内膜活检。而基因检测作为近几十年来迅速发展起来的新兴科技手段，其在妇科肿瘤的筛查与诊断中也起着越来越重要的作用。
目前，常用的基因检测技术主要分为以下4种：（1）核酸印迹杂交：从核酸分子混合液中检测特定大小核酸分子的方法，基于核酸变性和复性原理，根据被检样品不同又可分为DNA杂交（southern blot）、RNA杂交（northern blot）、点杂交和原位杂交。（2）聚合酶链反应（PCR）：扩增被检靶基因以提高敏感性。（3）DNA测序：识别DNA中的4种碱基，逐一读出全部基因序列，其双向测序是基因检测结果金标准，可用于检测未知基因。（4）基因芯片技术：是近年来发展十分迅速的大规模、高通量分子检测技术，生物样本中基因靶序列与固定有大量基因探针的基因芯片进行特异性杂交，检测其标记信号，对被检DNA序列信息进行高效解读和分析。
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基因检测与宫颈癌
宫颈细胞学检查作为宫颈癌的主要筛查手段已持续60余年，直到1995年在国际癌症研究机构（IARC）专题讨论会上，明确HPV感染是宫颈癌的关键和必要致病因素；其中，高危型HPV持续性感染与宫颈癌的发病密切相关，提出将HPV的检测作为筛查的手段之一。从HPV感染到宫颈癌发生会经过一系列癌前病变：鳞状上皮内病变（SIL），包括低级别SIL（LSIL，即子宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ）和高级别SIL（HSIL，即CIN Ⅱ～Ⅲ）。
HPV检测方法有多种，总的来说，主要是通过DNA检测、RNA检测直接检测HPV基因（多针对HPV基因组的L1或E6/E7区域）以及HPV相关信号通路蛋白变化的检测。目前，从原理上讲，HPV基因检测方法主要分两大类：（1）使用液相杂交放大信号：如2代杂交捕获法（HC2）、CervistaHPV等，敏感度较低，操作较繁琐。（2）PCR扩增靶基因序列：如Cobas 4800、Aptima mRNA等，敏感度高，其中HPV DNA的定量检测还可用来评估病毒负荷量。除此之外，还有高危HPV亚型mRNA编码蛋白E6和E7的检测。
目前，在美国及欧洲经过食品药品管理局（FDA）批准的HPV检测有4种：（1）HC2：核酸杂交法定量检测，可检测13种HPV高危亚型。（2）Cervista HPV HR：比HC2多检测1种HPV高危亚型（HPV 66）。（3）Cobas 4800系统：基于PCR技术，检测14种高危亚型，同时可对HPV16和HPV18进行分型，敏感度高，可在1000个细胞DNA量中检测出低于10个拷贝的HPV DNA。（4）AptimamRNA：鉴定E6和E7 RNA，可检测14种高危亚型，与HC2敏感度相似，特异性也比较好。
HPV检查最初用于宫颈细胞学诊断非典型鳞状细胞之后的分流：后续进行阴道镜检查或密切随访。与细胞学检查相比，HPV检查的阴性预测值高但特异性较低。采用PCR法进行的HPV检测假阴性率0，特异性60.7%，敏感性90%；而细胞学假阴性率约50%，敏感性30%～87%（根据实验室、标本满意度、制片技术及阅片人员经验不同而变化）。一项基于人群的研究显示30%～60%有浸润性宫颈癌的妇女在诊断前3～5年宫颈细胞学结果显示正常，提示阴性细胞学结果可持续的时间较短，至少每3年应进行1次。而也有研究显示，高危型HPV检查阴性的妇女可有5～18年的癌前病变低风险保障。
综上，HPV检测在宫颈癌筛查中的主要用途有以下几点：（1）筛查方案确定及其年龄分组和时间间隔：目前推荐每5年1次HPV检测联合细胞学检查作为30岁以上妇女的最佳筛查手段，而21～29岁妇女可只行3年1次的细胞学检查，若发现非典型鳞状细胞（ASC-US）再行HPV检测，65岁以上妇女若连续3次细胞学检查阴性或2次联合筛查阴性且最近1次在5年内则可停止防癌筛查。（2）基因分型：约70%宫颈癌由HPV16、HPV18引起，余30%由其他高危型感染导致。因而，HPV分型检测可一定程度上估测患者近期发生CIN的风险。（3）后续检查或治疗方案制定：若HPV检测高危型阳性，同时有异常宫颈细胞学检查结果，则需进行阴道镜取宫颈活检，若HPV阳性而细胞学阴性则需间隔1年后继续联合筛查，若HPV阴性而细胞学阳性，则可间隔3年进行联合筛查。（4）术后随诊复查：宫颈癌和CIN术后仍有可能复发和残留，需定时进行宫颈或阴道残端HPV及细胞学检查。
除常规的HPV检测和宫颈细胞学检查外，在美国加州进行的一项前瞻性观察研究中，1509例进行了联合筛查的HPV阳性患者中，Wentzensen等研究了在细胞玻片上进行p16/Ki-67双染对于宫颈癌前病变的检测价值，结果显示，相比常规细胞学ASC-US的阈值（53.4%），双染法阳性率更低（45.9%）。而对于CIN Ⅱ的检测，双染法敏感性与常规细胞学相近（83.4%和76.6%），统计学上具有较高的特异性（58.9%和49.6%）、阳性预测值（21.0%和16.6%）以及阴性预测值（96.4%和94.2%）。对于CIN Ⅲ亦有相似结果。双染阳性患者风险较高需进行后续阴道镜检查，阴性患者1年后复查即可。因而，提出p16/Ki-67可作为潜在的病变分流标志物。
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基因检测与卵巢癌
大部分卵巢癌为上皮性来源，其主要组织亚型为浆液性（68%～71%），内模样（9%～11%），透明细胞型（12%～13%）和黏蛋白性（3%）。而近年关于卵巢癌分类的新理论认为，上皮性卵巢癌可分为两类：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型肿瘤由交界性浆液性肿瘤、子宫内膜异位症或卵巢表面上皮发展而来，包括低级别浆液性癌、子宫内膜样癌、黏液性癌以及透明细胞癌，通常表现为早期和低级别肿瘤，病程发展相对缓慢。Ⅱ型肿瘤更常见，通常为高级别肿瘤，包括高级别浆液性、高级别子宫内膜样癌以及未分类恶性肿瘤，目前认为起源于输卵管伞端上皮，由于其易发生腹腔种植转移，诊断时多为晚期癌症。
由于两种类型上皮性卵巢癌的内在性质不同，其分子谱也各不相同。Ⅰ型肿瘤基因检测可表现为：KRAS、BRAF、ERBB2、CTNNB1、PTEN、PIK3CA、ARID1A、PPP2R1A及BCL2等的突变。KRAS、BRAF和ERBB2突变影响促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，刺激细胞生长，分裂和肿瘤发生；PIK3CA和PTEN可影响在蛋白质合成、细胞运动、增殖和凋亡中有重要作用的PI3K/MTOR/AKT途径；ARID1A编码BAF250蛋白，在染色质变构和调节DNA修复、细胞分化和增殖中起重要作用；CTNNB1编码β-catenin，其突变可通过影响WNT通路、胞内信号传导及细胞黏附来调节细胞运动、分化及生长。另一方面，Ⅱ型肿瘤主要特征为TP53突变，其次是BRCA1/2失活。据癌症基因组图谱数据集（cancer genome atlasdataset，TCGA）示，约96%高级别浆液性卵巢癌中均可检测到TP53突变。TP53编码p53，是一种转化因子蛋白，涉及DNA修复、细胞周期调节和凋亡。另外，40%～50%散发高级别浆液性卵巢癌患者发现有BRCA1/2失活，通常由基因甲基化或体细胞自身基因突变导致。
除去因获得性基因损伤导致的肿瘤外，约有10%上皮性卵巢癌发生于遗传性BRCA基因突变的妇女，且多表现为高级别浆液性卵巢癌，其中BRCA1突变的发生率约为BRCA2的2倍。BRCA1和BRCA2分别位于17和13号染色体，与双链DNA损伤修复有关，其突变能增加人体对癌症（尤其是乳腺癌和卵巢癌）的易感性，是大部分家族性乳腺癌和卵巢癌的责任基因。携带有突变BRCA1/2基因的妇女患卵巢癌的终身危险分别为20%～60%和10%～40%。由于卵巢癌的高病死率及缺乏有效筛查和预防手段，携带突变BRCA的妇女被强烈推荐在分娩后进行预防性双侧卵巢输卵管切除（BSO）。4.4%～17%的BRCA1/2携带者在进行预防性手术时检查出早期癌变。以前，BSO主要基于阳性家族史进行，因而，后代中有许多非携带者错误地进行了手术。而在基因检测技术发达的现在，可通过BRCA1/2突变分析及卵巢癌其他突变基因的检测，鉴别有突变的高危人群。目前，针对高危人群，BSO是惟一能够降低病死率的有效手段，若患者还有生育要求或不愿意进行手术，则推荐其进行阴道超声和HE4、CA125检查进行定期监测。目前，尚不推荐对普通人群进行卵巢癌筛查。
近年，也有许多研究报道可采集肿瘤患者循环血液中的游离DNA，检测其特定基因甲基化水平，进行卵巢癌的早期诊断、评估预后以及对治疗的反应性等。一般从血液中获取的DNA有两种来源：循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环肿瘤细胞（CTCs），其释放机制目前尚不明确。而对于ctDNA的一个最直接应用就是“液体活检”。有研究使用由RASSF1A，BRCA1，APC，DAPK，p14和p16 6种肿瘤抑制基因组成的检测板通过甲基化特异性PCR技术对50例卵巢癌患者血清进行检测，至少检测出一种基因有肿瘤特异性甲基化的特异度为100%，敏感度82%，包括13/17例Ⅰ期肿瘤。其中，15例ⅠA或B期患者的腹水标本仅1例检测出基因甲基化，其对应的血清则有11例可检出甲基化。其余40例对照患者的非肿瘤组织、腹水或血浆均未检出甲基化。也有研究对30例卵巢癌患者单独进行DAPK甲基化检测，结果显示，67%的肿瘤组织甲基化和54%ctDNA甲基化，对照健康人群的血DNA则均未检出甲基化。以上说明ctDNA可作为一项非侵入性检查对早期卵巢癌进行筛查，且效果优于其他液体标本。值得注意的是，不像GSTP1甲基化可表现在90%以上的前列腺癌中一样，目前，尚未有单独某个基因甲基化在相对较小比例的卵巢癌中发现，所以，检测卵巢癌需要几种甲基化基因组成一组以保证足够高的特异度和敏感度。
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基因检测与子宫内膜癌
子宫内膜癌也可被分为两种主要类型。1型占80%～90%，通常是雌激素依赖型子宫内膜样腺癌，一般预后良好。2型肿瘤通常诊断较晚，更具侵袭性，预后较差。此型的发生不依赖雌激素，有高复发和转移风险，最常见病理类型为浆液性乳头状癌和透明细胞癌。
同卵巢癌，5%～10%的内膜癌发生于有遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC，也称Lynch综合征）的人群，它是一种发生于DNA错配修复系统的常染色体显性遗传性疾病。其中，两个最常见的错配修复基因突变为：MSH2和MLH1，分别位于染色体2p16和3p21，有此突变的患者70岁时发生子宫内膜癌的风险为42%。其他已鉴定的突变基因为MSH6，PMS1和PMS2，但是，发生的频率较低。错配修复系统有缺陷的细胞表现出微卫星不稳定性现象（微卫星：基因组中包含简单重复DNA碱基序列的区域，如CACACACA或AAAA，特别容易突变）。一般使用5个公认微卫星标志物，即D2S123、D5S346、D17S250、Bat25和Bat26，来检测微卫星不稳定性。几乎所有HNPCC相关的结直肠癌和子宫内膜癌均可检测出微卫星不稳定性，但约有25%散发的子宫内膜癌会由于启动子甲基化引起基因沉默导致外源性错配修复基因失活，尤其是MLH1，而表现出微卫星不稳定性。对于经询问家族史后判定具有HNPCC高危因素的患者，目前，有许多商业基因检测可供选择。但大部分研究者仍推荐对最常涉及的MLH1和MSH2两个基因进行全基因测序。一旦检测到突变，可行预防性全子宫切除术，而由于有突变的患者同时患卵巢癌的风险为10%，故可酌情行双侧输卵管卵巢切除术。一项对有基因突变患者进行的研究显示，61例行预防性手术的患者无子宫内膜癌发生，而其余210例未行手术的患者则最终有69例发生子宫内膜癌。由此可见，对于错配修复基因的检测可评估有HNPCC家族史人群发生子宫内膜癌的风险，并为预防性手术的进行提供依据。
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总结与展望
癌症是一种基因疾病，遗传性或获得性基因缺陷可导致癌症的发生和发展。而如今发达的基因分子检测技术已使我们可以鉴定许多妇科恶性肿瘤中的基因突变。癌症的分子表征可以让我们更好地理解肿瘤形成及不同类型肿瘤的临床特征，这对以后发展出更好的筛查试验和预后生物标志物有重要的意义。
然而，从目前妇科三大恶性肿瘤的筛查现状来看，除了HPV检查已广泛应用于宫颈癌筛查外，其他肿瘤的筛查仍主要依靠影像学与组织学手段，目前所知的各肿瘤分子标志物对于妇科恶性肿瘤的应用大部分仅停留于科学研究阶段，说明基因检测技术在妇科肿瘤中的发展仍比较缓慢。但若能将这些研究结果应用起来，应该可以发展出针对妇科恶性肿瘤中关键基因缺陷进行纠正的新型靶向基因疗法。希望未来的研究能侧重于将这些基因改变转化为临床上癌症预防、筛查以及治疗的目标。
